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熒光染料的定義：
熒光染料（也稱為熒光團/活性染料）可以簡單地描述為分子（本質上是非蛋白質），在顯微鏡下，通過吸收給定波長的光并以更長的波長重新發射光來實現其功能。 這種熒光產生不同的顏色，可以可視化和分析。
熒光染料通常用于各種生物分子（抗體、肽、各種蛋白質等）的熒光標記，用于監測藥物向目標組織的輸送、成像等過程。

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熒光染料分類：
※ 有機熒光染料
※ 生物熒光基團

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一、有機熒光染料
       本質上，有機染料的特征在于源自在整個生色團上離域的光學躍遷或源自分子間電荷轉移躍遷（從激發電子態的分子內電荷轉移）的發射。
       在這里，表現出源自在整個生色團上離域的光學躍遷的發射的染料被稱為共振染料（介觀染料），而后者被稱為 CT 染料（電荷轉移染料）。花青、羅丹明和熒光素是一些最常見的共振染料，其特點是窄的吸收和發射帶（略微結構化），往往相互鏡像，以及小的、對溶劑極性不敏感的斯托克斯位移。
      另一方面，CT 染料包括香豆素和丹磺酰熒光團等染料，其特點是與共振染料相比，吸收和發射帶結構無結構，分離良好，以及更大的斯托克斯位移。
      同樣，與共振染料相比，CT 染料具有更小的摩爾吸收系數和熒光量子產率。
※ 對于共振和 CT 熒光染料，在結構-性質關系眾所周知的情況下，可以通過精心設計的策略來微調光譜性質。
1.有機熒光染料的種類:
a. 熒光素
與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機染料。 熒光素 的最大吸收波長為 494nm，最大發射波長為 521nm（通常吸收藍色范圍內的光并發射綠色范圍內的光），熒光素是一種高熒光物質。 即使在非常少量的情況下也可以檢測到它，并且在與抗體結合時用于顯微鏡檢查。
熒光素的衍生物包括異硫氰酸熒光素、俄勒岡綠和羧基萘并熒光素等。 與許多其他熒光染料一樣，熒光素價格低廉且易于使用，使其成為生物學研究中最受歡迎的染料之一。
與大多數其他染料不同，熒光素在水溶液中是無毒的。 因此，它是極少數用作地下水示蹤劑的染料之一。

b. 異硫氰酸熒光素 (FITC)
異硫氰酸熒光素是流式細胞術和免疫熒光中最常用的有機熒光染料/探針之一。 它的特點是最大/峰值吸光度為 495nm，發射波長為 520nm，熒光素與熒光素之間的相互作用導致能量轉移和濃縮時的自猝滅。
異硫氰酸熒光素染料標記分子應用：
(a)電泳分離后的蛋白質檢測
(b)蛋白質和肽的微測序分析
(c)使用毛細管區帶電泳進行分子分析
(d)生物相互作用中的分子跟蹤和檢測
(e)細胞和組織切片中的抗原檢測
(f)通過標記 DNA 片段進行細胞凋亡檢測
除了因其在水中的溶解性而易于用于偶聯物制備外，異硫氰酸熒光素還具有明亮的熒光（由于偶聯后的大消光系數和高量子產率），使其成為許多工藝的首選染料。
※ 在流式細胞術和免疫熒光顯微術中，染料與各種抗體（一抗或二抗）結合，以檢查和研究IL-17免疫缺陷和CD63在腎功能中的作用等狀態。
※ 作為熒光素的衍生物，異硫氰酸熒光素含有一個異硫氰酸酯反應基團，這有助于其對通常存在于生物分子中的動漫和巰基基團具有反應性。

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※ 流式細胞術簡介
免疫熒光顯微術涉及在顯微鏡下觀察化學標記的分子，而流式細胞術涉及在流式細胞儀中檢測和測量此類分子的特征。
在流式細胞術方法中，來自給定培養物/組織樣品的細胞懸液（單細胞懸液）在微量滴定器中與熒光團標記的抗體一起孵育，然后在流式細胞儀中進行分析。
在流式細胞儀中，使用鞘液聚焦懸浮液，使其細胞一次一個地通過激光束。 然后檢測發射的光（來自標記細胞的熒光）用于分析。

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c. 花青熒光染料
花青類熒光染料屬于共振染料，其特征在于具有離域電荷的氮原子（兩個氮原子）之間的聚甲炔染料。 由于與生物分子的低非特異性結合以及明亮的熒光，花青類熒光染料已成為一些最流行的用于標記核酸的熒光染料。
花青類染料分為兩大類：
※ 非磺化花青類染料 - 該組中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。 在大多數情況下，這些染料的特點是水溶性低，但胺的鹽酸鹽和酰肼除外。
它們首先溶解在有機溶劑（共溶劑）中，然后在生物分子標記期間添加到含有生物分子的溶液中。
而“Cy”代表花青，第一個數字代表存在于亞油啉基團之間的碳原子數。 另一方面，添加 0.5 后綴以表示苯并稠合花青。 這些熒光染料通常用于有機介質。
※ 磺化類花青染料 - 該組由磺基-Cy3、磺基-Cy5 和磺基-Cy7 組成。 顧名思義，這些花青的特征是一個磺基，它有助于染料分子在水相中的溶解。
與非磺化花青相比，這些花青更易溶于水，因此不需要溶解在有機溶劑中進行標記。 磺化花青通常用于標記疏水性蛋白質、水溶液中的納米顆粒以及可能被 DMSO 或 DMF 變性的敏感蛋白質。
※ 兩組染料均可用于標記以下生物分子：
肽、寡核苷酸和 DNA、抗體、可溶性蛋白質。

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d.羅丹明熒光染料
與 曙紅(Eosin) 和 熒光素一起，羅丹明屬于呫噸族。 與市場上的許多其他染料相比，羅丹明具有出色的光穩定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。
它們在聚合物納米粒子表面的表征、聚合物-生物偶聯物的檢測、活細胞的成像以及寡核苷酸在膠乳上的吸附分析等方面特別有用。
羅丹明熒光染料的衍生物也用作：
分子開關，病毒表面修飾，化學傳感器，硫醇。
不同類型的染料通過它們各自的取代基（R1、R2、R3、R4 和 G）來區分。 由于它們的差異，這些熒光染料在溶液中也表現出不同的光物理特性（例如不同的熒光壽命和發射最大值）。
氨基被剛性化的羅丹明染料無論溫度范圍如何都表現出高量子產率，而在每個氮處具有兩個烷基取代基的那些表現出活化的內部轉化，量子產率和熒光壽命隨溫度的變化而變化。
※ 羅丹明 101 和羅丹明 B 是一些最常用的羅丹明染料，具有以下特點：
--羧基傾向于在酸性溶液中質子化
--染料轉化為兩性離子堿性溶液
--兩性離子染料在極性較小的有機溶劑中變為無色內酯
* 要將羅丹明用作熒光探針，必須對其進行修改。 這可以通過(the xanthene moiety)氨基、羧基苯基環或羧酸基團的修飾來實現。
* 與 TRITC 一樣，羅丹明 (NHS-rhodamine) 的 熒光特性為 544nm（最大吸收波長）和 576nm（最大發射）。
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二、生物熒光基團
在 1990 年代首次使用的綠色熒光蛋白（從水母維多利亞水母克隆）及其衍生物（例如藻紅藍蛋白、藻膽蛋白和藻紅蛋白等）是當今生物學研究中最常用的一些生物熒光團。
雖然熒光團可用于在細胞、細菌和各種器官中表達質粒，但它們的使用有一些缺點，即它可能很耗時，并且在融合時還能夠改變某些細胞蛋白的正常生物學功能。
此外，與許多其他熒光團相比，生物熒光團的光穩定性和靈敏度較低。
1. 綠色熒光蛋白 (GFP)
綠色熒光蛋白是最流行的生物熒光團之一，由 238 個氨基酸組成，其中三個負責發出可見綠色熒光的結構。 在水母本身中，熒光團與水母發光蛋白（一種蛋白質）相互作用，當添加鈣時會發出藍光。
通過 DNA 重組，研究人員可以使用負責產生蛋白質的基因來研究給定的基因和蛋白質。 在這里，在將復合物插入細胞之前，該基因與另一個基因（負責產生所需蛋白質的第二個基因）結合。
如果細胞產生綠色熒光，研究人員就可以明顯看出該細胞能夠表達目標基因。
* GFP 由 488nm 激光線激發，可在 510nm 處檢測。
* 來自熒光團的微弱信號可以使用抗 GFP 抗體放大。
作為生物標記物，綠色熒光蛋白用于以下功能：
* 監測各種生理過程
* 識別蛋白質定位
* 檢測轉基因表達

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2. 生物熒光團包括：
※ 藻紅蛋白 - 藻紅蛋白 (PE) 是一種紅色蛋白色素復合物，屬于藻膽蛋白家族。 它可以在紅藻和隱植物中找到，它作為葉綠素色素的附屬物。
在生物科學中，熒光團可以與蛋白質結合，例如用于抗原檢測的抗體等，因為它能夠發出明亮的熒光。 由于熒光團往往會很快發生光漂白，因此很少在熒光顯微鏡中使用。 它經常用于流式細胞術。
※ 別藻藍蛋白 (APC) - 與藻紅蛋白一樣，別藻藍蛋白也屬于藻膽蛋白家族，是從紅藻中分離出來的。 在 594 和 633 nm 的激光線激發下，熒光團的最大吸光度在 650 nm 處，而熒光發射峰在 66 nm 處。
與熒光素偶聯物相比，熒光團的靈敏度已顯示高 5 至 10 倍，并具有許多其他有益特性，包括大斯托克斯位移、高水溶性、長波長發射和耐猝滅。
雖然別藻藍蛋白通常不用于需要光穩定性的應用，但它廣泛用于流式細胞術、ELISA、微陣列等過程以及各種依賴高靈敏度的應用。

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3. 量子點
量子點開發于 1980 年代，是尺寸范圍在 2 到 50nm 之間的納米晶體（無機納米晶體）。根據大小，發出的光會從藍色變為紅色（小的 QT 呈現藍光，而較大的 QT 呈現紅光）。
與當今使用的其他一些熒光團相比，量子點具有很大的優勢，因為可以通過控制粒徑、表面化學、分布以及組成材料來控制/調節它們的光學特性。
因此，它們適用于免疫標記、多重生物檢測以及體外和體內分析的分子成像等過程。
探針的主要特征之一是由于量子尺度效應，它們具有寬的激發波長范圍以及窄的發射范圍。
通過利用這一特殊特性，可以在同一光源下激發多色量子點，實現對生物樣本中多個目標的多路檢測和觀察。

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a.量子點與其他熒光團不同的一些有益特性包括：
* 表現出 40% 至 90% 的高量子產率
* 非常高的熒光強度 - 這比羅丹明 6G11 分子亮約 20 倍
* 高度抗光漂白
* 探頭尺寸越大，發射波長越長
注意：量子點的主要缺點之一是發光間歇性（閃爍），這可能會影響分子檢測的某些過程。
為了將生物分子連接到量子點（生物共軛），使用了以下策略：
* 電子相互作用——使用表面活性劑（如巰基乙酸）來修飾量子點表面并提高溶解度。
* 共價連接 - 涉及使用諸如將分子的官能團（例如羧基和氨基官能團）連接到量子點表面的策略。
* 作為介質的功能化微珠——可能涉及將量子點封裝到聚合物微珠中，這使得它們表面的官能團能夠與生物分子結合。
* 碳基量子點（例如石墨烯量子點）是新一代探針。 除了保留傳統量子點的許多優點外，它們還被證明在生物共軛過程中表現出更有益的特性，而且細胞毒性很小。

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4. 納米粒子
納米顆粒是指尺寸在 1 到 100 納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類型的細胞和組織的熒光成像。
當今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點、貴金屬納米顆粒、聚合物點、量子點和熒光摻雜二氧化硅等。
在成像中，與其他分子熒光團和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優勢，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過程中獲得更好的結果。
此外，與各種分子熒光團相比，納米顆粒和納米材料沒有細胞毒性，并且不受非特異性結合問題的影響。由于這些特性，大多數熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以內化到細胞/組織中，并容易靶向給定部位。

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