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鈣離子成像原料？鈣熒光探針實驗注意事項

鈣（Ca2+）是一種重要離子，在多種細胞功能中發(fā)揮作用。作為一個小離子，它可以在細胞質(zhì)和細胞隔室中自由快速移動。Ca2+可以作為從肌肉細胞（肌細胞）到神經(jīng)元和其他許多細胞活動的快速指示劑。該領(lǐng)域的工作可以追溯到20世紀70年代Roger Tsien及其合作者在EGTA的Ca2+螯合特性方面的開創(chuàng)性工作。在此后的幾年里，鈣指示劑（Ca2+指示劑）的發(fā)展繼續(xù)為細胞生物學的基礎(chǔ)提供了深刻的見解，例如，細胞在不同疾病狀態(tài)下的反應，或?qū)χ委熕幬锏姆磻Ｔ诒疚闹校覀儗⒀芯坑糜诒O(jiān)測鈣信號、局部鈣水平的不同熒光指示劑，并研究它們在細胞和隔室中的流量或空間動態(tài)。

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單波長鈣測量

使用最方便、最快的Ca2+指示劑是單波長染料。這些通常用于指示活動，它們對共焦成像更友好，因為它們通常與常見的激發(fā)和發(fā)射波長以及光源相匹配。

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Fluo-4相對明亮且穩(wěn)定，因此可以在較短的曝光時間內(nèi)獲得強信號，并且光毒性最小，因為它也不需要產(chǎn)生更多活性氧的紫外線波長。Fluo-4是一種低親和力的Ca2+指示劑，這意味著它可以在飽和前測量高Ca2+濃度，但在低Ca2+濃度（如靜息細胞的Ca2+濃度）下測量效果不佳。在單波長測量中，通常使用比率F（t）/F（0）比較活動期間的熒光發(fā)射與靜止狀態(tài)的熒光發(fā)射。Ca2+濃度的定性測量可以通過這種方式實現(xiàn)，但這對定量測量造成了限制，需要對數(shù)據(jù)進行歸一化，以解釋實驗內(nèi)和實驗間的變化。潛在問題包括研究期間細胞的染料負載不均勻、光漂白和染料從細胞中泄漏。

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Rhod Dyes 
另一組單波長Ca2+指示劑是Rhod染料。雖然應用不太廣泛，但值得注意的是，它們將激發(fā)和發(fā)射轉(zhuǎn)移到更長的波長。例如，X-rhod-1的激發(fā)波長為580 nm，發(fā)射波長為600 nm。這種波長向紅色偏移的原理有助于減少組織內(nèi)的光毒性、自體熒光和光散射效應，因此紅色區(qū)域的Ca2+指示劑數(shù)量繼續(xù)增加。在更長波長下工作的另一個好處是允許與其他熒光蛋白標記進行多路復用，或者可能促進使用通道視紫紅質(zhì)對膜電位的光遺傳學控制（Lock et al.，2015）。

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細胞內(nèi)鈣Fura-2，Indo-1的比例染料

定量染料對定量工作很有用，因為它們可以校正成像條件和樣品制備中的許多變化，例如染料濃度的變化或光漂白效應。這允許在不同實驗之間對數(shù)據(jù)進行校準和標準化。比例Ca2+指示劑的發(fā)射光譜或吸收光譜隨著局部Ca2+濃度的變化而發(fā)生變化。這些染料的乙酰甲氧基（AM）酯化形式是首選的，因為它們在細胞膜上擴散，并被細胞內(nèi)酯酶裂解，使細胞裝載過程更容易和有效。

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Fura-2
在所有比例鈣離子指示劑中，F(xiàn)ura-2最為著名。Fura-2在340 nm和380 nm處表現(xiàn)出不同的吸收，這是Ca2+的函數(shù)（見下圖）。通過510nm左右的相對發(fā)射強度可以檢測到這種變化。

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因此，F(xiàn)ura-2的成像協(xié)議比單波長Ca2+指示劑的成像協(xié)議更復雜，并且需要能夠在340 nm和380 nm處提供照明的光源。Fura-2成像需要340 nm和380 nm的連續(xù)照明，檢測波長為510 nm，然后計算這對發(fā)射圖像的像素比率。通過對自由離子濃度進行校準，可以進一步分析圖像。Fura-2對Ca2+具有很高的親和力，因此非常適合在低水平下精確定量測量Ca2+，但不適用于非常高的濃度（通常高于1μM）。然而，有一些Fura-2染料的親和力較低，可以在較高的Ca2+濃度下進行測量。

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Indo-1
另一種著名的比例染料是Indo-1，但在這種情況下，染料在405 nm和485 nm處的兩個峰值附近改變其發(fā)射效率。Indo-1的激發(fā)波長約為340 nm，可以用以405 nm和485 nm發(fā)射峰為中心的濾光片依次成像。

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與Fura-2一樣，圖像是像素級的，可以根據(jù)游離Ca2+濃度進行校準。Indo-1的一個潛在問題是，在某些實驗條件下，它可能相對不穩(wěn)定。它通常用于流式細胞術(shù)測量，而這不是問題。